PCR程序中的退火温度和循环次数受哪些因素影响
来源:学生作业帮助网 编辑:作业帮 时间:2024/05/15 00:48:22
PCR程序中的退火温度和循环次数受哪些因素影响
退火温度基本和引物有关,如果产物特异性不好,可以适当提高退火温度.
循环次数是你自己定的,如果模板量低(产物量少)就多循环几圈,不过最好别超过35个,里边的成分都耗损的差不多了.再循环也没大用了.
退火(复性)温度与时间:退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃~60℃,可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸,G+C含量约50%的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮...
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退火(复性)温度与时间:退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃~60℃,可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸,G+C含量约50%的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度: Tm值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T) 复性温度=Tm值-(5~10℃) 在Tm值允许范围内, 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合, 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30~60sec,足以使引物与模板之间完全结合。
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