如何能够在双元载体里面插入目的片段RT

来源：学生作业帮助网编辑：作业帮时间：2024/05/07 01:26:49

如何能够在双元载体里面插入目的片段
RT

1、用Sal I和BamH I双酶切得到目的片段,然后用Klenow Fragment或T4 DNA聚合酶等补齐,这样目的片段的2端都是平末端.
2、用BamH I单酶切载体,然后用Klenow Fragment或T4 DNA聚合酶等补齐,使载体的2端也成平末端.
3、将补齐后的目的片段连入补齐后的载体片段（目的片段无论是正向插入还是反向插入,BamH I酶切位点都没有了）.然后采用酶切的方法筛选、鉴定所需的重组质粒.即,在目的片段的5"端或3"端选择一个酶切位点（目的片段上只有唯一的一个,而且应该尽量靠近目的片段的5"端或3"端,只要能区分片段的大小就行）；此外,载体上应该没有该酶切位点.然后用所选择的酶切位点的相应内切酶和Sal I酶切,通过酶切产生的小片段的大小就可判断目的片段的插入方向,选择你需要的（正向插入,暂且命名为质粒1）.
4、用Sal I单酶切质粒1,再用Klenow Fragment或T4 DNA聚合酶等补齐,使质粒1的2端也成平末端.
5、将补齐后的目的片段连入补齐后的质粒1片段（目的片段无论是正向插入还是反向插入,Sal I酶切位点也都没有了）.同样,采用酶切的方法筛选、鉴定所需的重组质粒.即,在目的片段的5"端或3"端选择一个酶切位点（目的片段上只有唯一的一个,而且应该尽量靠近目的片段的5"端或3"端,只要能区分片段的大小就行）；此外,载体上应该没有该酶切位点（用上面所选的酶切位点应该就可以）.然后用所选择的酶切位点的相应内切酶酶切,通过酶切产生的小片段的大小就可判断目的片段的插入方向,选择你需要的反向插入就行了.

如何能够在双元载体里面插入目的片段RT 本人实验,现在手上有pCDNA3.1-EGFP载体,现在想在载体上插入目的基因PTEN片段,应该怎么做? 最近在做转化实验,转化到大肠杆菌里面,请问一下什么是假阳性啊是不是指载体没有与目的基因连接,就直接进行转化,如果是这样,在进行“蓝白斑”筛选时,原理是当外源片段插入到载体质粒构建基因表达载体时如何保证目的基因插入位置在启动子与终止子之间 PCR法如何确定载体中插入片段的长度大小? 请教一个双元表达载体的问题,双元表达载体系统代表农杆菌转化需要两个质粒吗?一个是含有插入位点能够插入目标基因的mini载体含有能够被转移的T-DNA,另一个是卸甲载体不含T-DNA只含有Vir 构建RNA干涉载体时,正反向目的片段中间插入的内含子有何要求? 为什么目的基因不能直接插入载体? 载体DNA必须有一个或多个限制酶的切割位点,以使目的基因可以插入到载体上去.“这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置,还必须是在质粒本身需要的基因片段之外,这样才不至于因目基因工程中如何避免载体的自我环化和目的基因的双向插入? 如何根据电泳图确定载体和目的片段的加入量能不能用PCR直接扩增目的片段,然后转入表达载体,代替在克隆载体或dh5a中的扩增判断以下句子的正误1.每条染色体上含有的基因数相同2.基因全部位于细胞核内3.构建基因文库时,含不同插入片段的载体在受体菌中能储存并克隆目的基因4.携带目的基因的载体不必有遗传标单一酶切位点,如何判断插入基因的方向如果插入的片段两端均使用同一种限制性内切酶,单一位点插入质粒载体,如何鉴定是否有插入以及插入方向是不是插入目的基因的载体全都有标记基因? 目的基因片段与载体DNA连接的主要有? 大片段的RT-PCR现在在做RT-PCR,目的片段5500多bp,用什么样的反应体系和条件能P出来啊?..希望知道或做过这方面实验的帮帮忙,如果p出来,下一步用什么载体连接最好,实验室里有T3、pMD19-Tps：我的如何画出连有目的片段的载体结构图?想做个示意图,就是一个载体结构图和一个目的片段图（ORF）,两个图拉一个二合一的箭头,下面一个连接后的载体结构图,并标明了目的片段具体的位置的