提取线粒体、及其叶绿体的注意事项?中文回答,最好附上英语翻译?

提取线粒体、及其叶绿体的注意事项?中文回答,最好附上英语翻译?

原理:
分离要用的主要试剂是层析液.层析液是一种脂溶性很强的有机溶剂.叶绿体中的色素在层析液中的溶解度不同：溶解度高的随层析液在滤纸上扩散得快；溶解度低的随层析液在滤纸上扩散得慢.
层析分离叶绿体中的色素：将纸条画有滤液细线的一端置于烧杯中的层析液中,注意千万不要将滤液细线浸没在层析液中,否则会使色素溶解而导致试验失败.层析液是挥发性较强的有机溶剂,并且具有一定的毒性,所以在操作中要尽量用培养皿盖住烧杯口.
观察实验结果：最后滤纸条上将分离出四条色素带,颜色从上往下分别是橙黄色、黄色、蓝绿色和黄绿色,四种色素分别是胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a和叶绿素b.
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注意事项:
1.减去角:
为了尽量让层析液在滤纸上的扩散速度相等
2.加入二氧化硅:
为了研磨的充分,加碳酸钙是为了防止研磨时色素被破坏,加入丙烯来溶解色素.
3.加入酒精:
因为叶绿素溶于有机溶剂,所以要加酒精,就是用来溶解的啊!
4.加入CaCo3:
为了保护叶绿素分子不受损伤.
叶绿素不稳定的,容易被活细胞里的有机酸破坏
(老师教我们记这点的时候说:你们给我记住了!"盖世太保"("钙是太保")保护叶绿素啊..汗汗...|||)
Principle:
Separation of the main reagent is to use liquid chromatography.Liquid chromatography is a kind of fat-soluble strong organic solvent.The chloroplasts pigment in liquid chromatography the solubility of different:high solubility with liquid chromatography in the filter paper spread fast; Low solubility with liquid chromatography in the filter paper spread slowly.
Chromatography separation in the chloroplasts pigment:will note the picture has filtrate fine line end in beaker of chromatography liquid,pay attention to don't will filtrate fine wire submerged in liquid chromatography,or you will make pigment solution and lead to test failure.Liquid chromatography is volatile strong organic solvents,and has certain toxicity,so in the operation to try to use petri dish cover glass mouth.
To observe the experimental results:the article filter paper will separate the four pigment belt,color from up to down respectively is orange,yellow,turquoise and kelly,four kinds of pigment were carotene,lutein,chlorophyll a and chlorophyll b.
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Note:
1.Minus the Angle:
In order to try to get chromatography liquid in the filter paper on the diffusion velocity equal
2.Add silica:
In order to fully grinding,add calcium carbonate is to prevent the grinding pigment is destroyed,join propylene to dissolve the pigment.
3.Add alcohol:
Because the chlorophyll soluble in organic solvents,so want to add alcohol,is used to dissolve!
4.Join CaCo3:
In order to protect the chlorophyll molecule is not damaged.
Chlorophyll is not stable,easy to live in the cells of organic acid damage
(the teacher taught us to remember this:you give me remember!"gestapo" (" calcium is boyz ") to protect the chlorophyll ah..sweat | | | sweat...)

泡桐叶绿体和线粒体的提取与分离
一、试验目的：
1、将泡桐叶片中的叶绿体和线粒体提取出来。
2、掌握植物叶片中叶绿体和线粒体提取与分离的基本技术。
3、学习蔗糖沉淀差速离心法和差速离心法提取线粒体的方法。
二、实验材料与仪器：
实验材料：泡桐新鲜叶片。
实验试剂：蒸馏水；液氮；缓冲液A（50 mmo l/L Tr is,，25 ...

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泡桐叶绿体和线粒体的提取与分离
一、试验目的：
1、将泡桐叶片中的叶绿体和线粒体提取出来。
2、掌握植物叶片中叶绿体和线粒体提取与分离的基本技术。
3、学习蔗糖沉淀差速离心法和差速离心法提取线粒体的方法。
二、实验材料与仪器：
实验材料：泡桐新鲜叶片。
实验试剂：蒸馏水；液氮；缓冲液A（50 mmo l/L Tr is,，25 mmo l /L EDTA，1.25 mo l/L N aC l ，10 mmo l/Lβ-巯基乙醇, ψ=0. 1% (W /V ) BSA (牛血清蛋白) , ψ= 2% (W /V) CTAB, 10 g /L PVP, pH = 8. 0）；缓冲液B (Tris2HCl 0.105 mol/ L, 蔗糖0.15 mol/ L, EDTA 0.1005 mol/ L, BSA 0.11% , 巯基乙醇0.11%, pH =7.15)；缓冲液C( Tris2HCl 0.105 mol/ L, 蔗糖0.13 mol/L, MgCl2 0.101 mol/ L, pH 7.15)；缓冲液D( 0. 2 mol/ L 蔗糖、0. 3mol/ L 甘露醇、50 mol/ L Tris2Cl、1 mol/ L EDTA、0. 1% BSA 、0. 6% PVP、0. 1% B2巯基乙醇,pH 7. 5)；缓冲液E( 蔗糖0. 3 mol/ L、50mol/ L T ris2Cl, pH 7. 5)；缓冲液F( 50 mol/ LTris2Cl、0. 3 mol/ L 甘露醇、0. 2 mol/ L 蔗糖、0. 1% BSA、0. 6% PVP, pH = 7. 5)；纱布等。 试验仪器：研钵，研磨棒；离心管（250ml）；高速冷冻离心机；移液枪；高速组织捣碎器等
三、 试验步骤： 1、叶绿体的提取与分离 (1) 称取新鲜泡桐叶片50 ~ 100 g, , 暗处理12小时，蒸馏水洗干净在液氮中保存3 h以上, 以最快速度磨成粉末, 然后用6层无菌纱布过滤, 收集滤液, 弃渣。 (2) 将滤液分装到250mL预冷的离心管中, 4℃下200r/min 离心5m in, 小心移出上清液到另一个新的预冷的离心管。 (3) 再在4℃ , 1500 r/min离心10m in, 小心抽去上清夜, 保留绿色沉淀颗粒, 避免光照(防止淀粉聚集)。 (4) 沉淀中加100mL缓冲液A ( 10mm o l/L巯基乙醇用前加入), 用无菌软毛笔充分悬浮沉淀, 4℃ 下1500 r/min 离心6m in, 弃上清液。 (5) 沉淀中加30mL缓冲液C, 用无菌软毛笔充分悬浮沉淀, 4℃ 下1500 r/min离心6m in, 弃上清, 沉淀为纯化的叶绿体。 2、线粒体的提取与分离 2.1 蔗糖沉淀差速离心法。 （1） 称取新鲜泡桐叶片50 g 左右, 预先暗处理，按3 mL/g 加入研磨缓冲液B (Tris2HCl 0.105 mol/ L, 蔗糖0.15 mol/ L, EDTA 0.1005 mol/ L, BSA 0.11% , 巯基乙醇0.11%, pH =7.15) , 用预冷的高速组织捣碎器捣碎至糊状, 尼龙纱布过滤, 收集滤液。 （2）滤液于1 200r/min, 4℃离心15 min。收集上清液后, 再于4℃ ,16 000 r/min离心20 min。加少量的预冷的悬浮缓冲液C( Tris2HCl 0.105 mol/ L, 蔗糖0.13 mol/L, MgCl2 0.101 mol/ L, pH 7.15) , 用毛笔轻搅沉淀。 （3）补加悬浮缓冲液至1/ 5 体积, 4℃, 1 200 r/min离心15 min。取上清液至另一离心管, 16 000 r/min离心20 min, 用2 mL 悬浮缓冲液悬浮沉淀, 按25 Lg/ g 鲜样加入DNase I, 冰浴2 h 以去除核基因组DNA。加入EDTA#Na2, 终浓度0.12 mol/ L, 终止反应。 （4）配制蔗糖梯度溶液, 按由高到低的顺序将蔗糖溶液60% ( 330µL) , 52% ( 830µL) , 36%( 1 mL) , 20% ( 830µL) , 依次铺入6 个5 mL 透明管中, 室温放置1 h, 然后将2 mL 粗制线粒体悬浮液平均铺于斜面上。100 000r/min, 4℃水平离心50 min (Beckman SW55) 。收集分层于36% ~ 52% 界面的线粒体, 置于冰上, 小心滴加4 倍体积的匀浆缓冲液( 未加巯基乙醇和BSA) , 混匀, 16 000r/min 4 ℃离心10 min, 沉淀即为纯化的线粒体。 2.2 高盐差速离心法 （1）线粒体提取。称取新鲜泡桐叶片50 g 左右, 预先暗处理左右, 加入3倍体积预冷的匀浆缓冲液D( 0. 2 mol/ L 蔗糖、0. 3mol/ L 甘露醇、50 mol/ L Tris2Cl、1 mol/ L EDTA、0. 1% BSA 、0. 6% PVP、0. 1%β-巯基乙醇,pH 7. 5) , 将预冷的组织用高速匀浆捣碎机破碎组织, 低速2 次, 每次5 s, 高速3 次, 每次8~ 10 s; 10min 后加入2 倍体积缓冲液E( 蔗糖0. 3 mol/ L、50mol/ L T ris2Cl, pH 7. 5) , 静置20 min, 经4 层纱布过滤, 分装于8 个50 mL 无菌离心管中; 取滤液以3 000 r/ min 和4 000 r/ min 各离心10 min, 以除去组织碎片和质体; 将上清液转入新的无菌离心管中,13 000 r / min 离心10 min, 弃上清, 得到粗线粒体沉淀; 在每管沉淀中加入缓冲液F( 50 mol/ LTris2Cl、0. 3 mol/ L 甘露醇、0. 2 mol/ L 蔗糖、0. 1% BSA、0. 6% PVP, pH = 7. 5) , 用毛笔轻刷沉淀使之充分悬浮后收集至50 mL 无菌离心管内。 （2）线粒体纯化。悬浮液4 000 r/ min 离心10min, 上清液转入新的离心管中, 加入Dnase 至终浓度25 Lg/ g, 同时加入终浓度为0. 01 mol/ L 的MgCl2 , 冰上反应2 h。在冰浴液中加入EDTA 至终浓度20 mol/ L, 终止DNase Ñ 反应; 将此溶液小心置于20 mL 0. 6 mol/ L 蔗糖介质上( 0. 3 mol/ L甘露醇、50 mol/ L Tr is2Cl、0. 6 mol/ L 蔗糖,pH 7. 5) , 13 000 r/ min 离心10 min。弃上清, 沉淀中加入0. 1 mL/ g 的缓冲液C , 轻轻悬浮均匀, 再次将此溶液小心置于20 mL 0. 6 mol/ L 蔗糖介质上,13 000 r/ min 离心20 min, 所得沉淀即为纯化的线粒体。
四、试验需要注意的问题：
1、泡桐叶片需要新鲜的叶片。
2、试验的仪器材料如研钵、离心管、蒸馏水等均需使用前灭菌。
3、在提取分离过程中操作所需要的温度、环境要尽量满足。
4、操作时要细心，造作技术要准确尽量减小操作误差。
5、使用试验仪器时注意安全。

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